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Evaluación del desempeño del sistema inmunoenzimático de diagnóstico DAVIH-HTLV-I, para la detección de anticuerpos contra el Virus Linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-I)
Evaluation of the performance of the immunoenzymatic diagnostic system DAVIH-HTLV-I for detection of antibodies against the human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-I)
Lic. Kenia Romero Martínez; Lic. María T. Pérez Guevara; Lic. Maelys Hernández Almaguer; Téc. Esperanza Sánchez Dieguez; Lic. Dayamí Martín Alfonso
Laboratorio de Investigaciones del SIDA (LISIDA). La Habana, Cuba.
RESUMEN
Introducción: el virus linfotrópico
de las células T humanas tipo I (HTLV-I), es el agente causal de la leucemia
/linfoma de células T del adulto (LLTA). Resultados hallados en estudios
de pesquisa para el HTLV-I en nuestro país demuestran sin lugar a dudas
la presencia del mismo en nuestra población. El DAVIH-HTLV-I es un sistema
microelisa para la detección de anticuerpos contra el HTLV-I en suero o
plasma humano, producido por Laboratorios DAVIH. El objetivo de este trabajo
fue evaluar el desempeño del sistema DAVIH-HTLV-I con vistas a su inscripción
en el Registro de Diagnosticadores, del Centro para el Control Estatal de la
Calidad de los Medicamentos (CECMED), exigencia indispensable para su uso en
nuestro país.
Métodos: se emplearon cuatro
paneles de muestras en los estudios de: especificidad, sensibilidad, eficacia,
concordancia con el sistema de referencia Vironostika HTLV-I/II (Biomeriéux),
precisión a dos niveles: repetibilidad (intraensayos) y precisión
intermedia (interensayos), y robustez.
Resultados: la evaluación mostró
los siguientes resultados: especificidad 99,84 %; sensibilidad 96,49 %; concordancia
96,55 %, límite de detección correspondiente a una dilución de
1/256; elevada precisión intra e interensayos (CV menores que el 15 % y
el 20 % respectivamente); sistema robusto frente a los cambios de temperatura
entre 36 y 38 °C.
Conclusiones: los resultados obtenidos
demostraron que el sistema DAVIH-HTLV-I se puede emplear en el pesquisaje de
anticuerpos contra el HTLV-I en la población cubana, por lo que se recomendó
su registro en el CECMED.
Palabras clave: evaluación de diagnosticadores; diagnóstico de HTLV-I; ELISA/métodos.
ABSTRACT
Introduction:
The human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-I) is the causal agent of adult
T-cell leukemia / lymphoma (ATLL). Screening for HTLV-I in our country has revealed
its unquestionable presence in the population. DAVIH-HTLV-I is a micro-ELISA
system produced by DAVIH Laboratories for detection of antibodies against HTLV-I
in human serum or plasma.
Objective: Evaluate the performance of the DAVIH-HTLV-I system with a
view to registration in the Registry of Diagnostic Media Products of the Center
for State Control of the Quality of Drugs (CECMED), an indispensable requirement
for its use in our country.
Methods: Four sample panels were used to study the following variables:
specificity, sensitivity, efficacy, concordance with the reference system Vironostika
HTLV-I/II (Biomeriéux), accuracy on two levels: repeatability (intra-assay)
and intermediate accuracy (inter-assay), and robustness.
Results: The following results were obtained: specificity 99.84%; sensitivity
96.49%; concordance 96.55%; detection limit for a 1/256 dilution; high intra-
and inter-assay accuracy (CV below 15% and 20%, respectively); a robust system
when faced with temperature changes between 36°C and 38°C.
Conclusions: Results show that the DAVIH-HTLV-I system may be used for
the screening of antibodies against HTLV-I in the Cuban population. It was therefore
recommended for registration with CECMED.
Keywords:
evaluation of culture media products, HTLV-I diagnosis, ELISA / methods
INTRODUCCIÓN
El virus linfotrópico de las células T humanas tipo I (HTLV-I), es el agente causal de la leucemia /linfoma de células T del adulto (LLTA) y se reconoce su implicación en la etiopatogenia de la paraparesia espástica tropical (PET) y otras enfermedades invalidantes.1 Este retrovirus comparte las mismas vías de trasmisión que el VIH 1/2.2 Resultados hallados en estudios de pesquisa para el HTLV-I en nuestro país demuestran sin lugar a dudas la presencia del mismo en nuestra población3,4. En estos momentos, Cuba no cuenta con un diagnosticador que permita pesquisar el HTLV-I y los estuches comerciales son muy costosos.
El DAVIH-HTLV-I es un sistema microelisa para la detección de anticuerpos contra el HTLV-I en suero o plasma humano, producido por Laboratorios DAVIH. Una de las exigencias indispensables para su uso en nuestro país es su inscripción en el Registro de Diagnosticadores del Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos, Equipos y Dispositivos médicos (CECMED),5 lo cual queda establecido en su Regulación No. 8-2001. Dentro de los requisitos se encuentra la evaluación del desempeño con estos fines, que incluye la comparación del diagnosticador con otro de calidad reconocida.5
El objetivo de este trabajo fue la evaluación del desempeño del sistema DAVIH-HTLV-I para su registro en el CECMED.
MÉTODOS
Aspectos generales y regulatorios
La evaluación siguió la metodología establecida en el LISIDA, en el PNO 01-0156, la Regulación No. 47-2007 del CECMED7 y la NC EN 13612:2005.8 Como algoritmo de trabajo se ensayó una sola réplica de cada muestra. Las muestras no concordantes con el resultado esperado, tomando como referencia el sistema microELISA Vironostika® HTLV I/II (Biomeriéux), se repitieron por duplicado y las que tuvieron resultados discrepantes en la segunda repetición se estudiaron por el sistema de Western blot DAVIH BLOT HTLV-I (Laboratorios DAVIH, Mayabeque, Cuba) como prueba confirmatoria. Las muestras con resultados indeterminados no se tuvieron en cuenta para el cálculo de la sensibilidad y la especificidad.
Técnica a evaluar
DAVIH-HTLV-I
El DAVIH-HTLV-I (Laboratorios DAVIH, Mayabeque, Cuba), es un ensayo inmunoenzimático heterogéneo indirecto, para la detección de anticuerpos contra el HTLV-I en suero o plasma humano, donde la reacción ocurre en los pocillos de la microplaca sensibilizados con el antígeno del HTLV-I. Los anticuerpos presentes en las muestras y controles reaccionan con el antígeno adsorbido a la fase sólida y se forma un inmunocomplejo que es detectado por una IgG anti FC de la IgG humana conjugada a peroxidasa. La presencia de la enzima inmovilizada en los complejos se revela añadiendo un sustrato cromogénico. Finalmente la reacción se detiene con ácido sulfúrico 2M y se efectúa la lectura de absorbancia (DO) a 492 nm. El nivel de corte del ensayo es igual a 0,350 unidades de DO.
En los ensayos se siguieron estrictamente las indicaciones de uso recomendadas por el fabricante.9
Muestras
Para la evaluación se emplearon muestras negativas provenientes de donantes de sangre y muestras positivas, previamente caracterizadas por Vironostika ® HTLV I/II y DAVIH BLOT HTLV-I, así como paneles de referencia de Boston Biomedica Inc (BBI Diagnostics).
Parámetros de desempeño estudiados
Especificidad
Para determinar la especificidad diagnóstica se ensayaron 1500 muestras de suero y 500 muestras de plasma de donantes sanos provenientes de Bancos de Sangre. Para estudiar la especificidad analítica, se ensayaron 180 sueros no reactivos al HTLV-I, con factores que pudieran interferir en los resultados debido a una reactividad cruzada: 45 con anticuerpos contra el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1; 20 con anticuerpos contra el Virus de la hepatitis C; 15 con antígeno de superficie al virus de la hepatitia B, 6 con anticuerpos antinucleares (lupus eritematoso sistémico); 10 de personas con artritis reumatoide; 5 con reagina rápida reactiva; 25 de nefrópatas; 10 de personas con hepatitis A; 19 de embarazadas; 15 lipémicas y 10 hemolíticas. Se calculó la especificidad diagnóstica y analítica.10
Sensibilidad
Para su estudio se ensayaron 15 muestras pertenecientes al “Anti-HTLV I/II Mixed Titer Performance Panel” (PRP 206) de la Boston Biomedica Inc (BBI Diagnostics). 14 muestras pertenecientes al “Anti-HTLV I/II Mixed Titer Performance Panel” (PRP 207 M) de la Boston Biomedica INC (BBI Diagnostics). 13 muestras positivas de la firma “Panel de Brasil” y 72 muestras positivas del Panel LISIDA cuyo origen comprende diferentes regiones geográficas identificadas como zonas endémicas para este virus y pacientes cubanos seropositivos al HTLV-I. Se calculó la sensibilidad diagnóstica.10
Concordancia
Se compararon los resultados obtenidos para las muestras de los estudios de sensibilidad y especificidad, por los sistemas Vironostika HTLV-I/II y DAVIH-HTLV-I. Se calculó el porcentaje de concordancia entre ambos sistemas.10
Precisión
La precisión fue evaluada a dos niveles: Intraensayo (Repetibilidad) e Interensayo (Precisión intermedia). Para la repetibilidad, se evaluaron las variaciones en 10 réplicas de tres muestras positivas con diferentes niveles de reactividad, caracterizadas por ELISA (Vironostika HTLV I/II) y por Western blot (DAVIH BLOT HTLV-I) dentro de un mismo ensayo y para la precisión intermedia se estudiaron las variaciones de estas muestras entre ensayos con dos lotes diferentes del diagnosticador.
Se emplearon como herramientas estadísticas la media (X), desviación típica estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV).10
Robustez
Se evaluó la robustez en dos de los parámetros del ensayo: la temperatura durante la incubación de las muestras y el conjugado, y la contaminación cruzada entre muestras reactivas y no reactivas durante el proceso de lavado. Se ensayaron 12 réplicas de dos muestras reactivas y dos no reactivas al HTLV-I, a 36°C, 37 °C y 38 °C. Se colocaron en la misma placa las muestras reactivas y no reactivas en forma alterna. Se emplearon como herramientas estadísticas la media (X), desviación típica estándar (DE) y el coeficiente de variación (CV).10
RESULTADOS
Especificidad
Especificidad diagnóstica:
La Especificidad diagnóstica fue de 99,84 %. Cinco muestras de suero fueron reactivas repetidamente, de ellas tres fueron confirmadas como negativas y dos como indeterminadas que fueron excluidas del estudio. Todas las muestras de plasma estudiadas resultaron no reactivas. Los resultados se muestran en la tabla 1.
Especificidad analítica:
En la tabla 2 podemos observar los resultados obtenidos para la especificidad analítica. La misma fue de 99,44 %. De las 180 muestras analizadas, con factores que pudieran producir reactividad cruzada, 178 fueron no reactivas por el sistema DAVIH HTLV-I y dos fueron reactivas: una positiva a VIH-1 y otra con anticuerpos antinucleares. Las dos muestras que resultaron reactivas fueron ensayadas por Western Blot DAVIH-BLOT-HTLV-I: la muestra positiva a VIH-1 se diagnosticó como indeterminada y se excluyó del estudio; la muestra con anticuerpos antinucleares se concluyó como negativa.
Sensibilidad
La sensibilidad diagnóstica del sistema fue de 96,49 %. De las 114 muestras positivas a HTLV-I, 110 fueron reactivas al HTLV-I y cuatro no reactivas: dos correspondieron a los paneles de la BBI PRP206 (muestra 01) y PRP207 (M) (muestra 02); y dos correspondieron al panel LISIDA, su origen geográfico se ubicó en la costa pacífica colombiana.
Concordancia
Los resultados obtenidos en el estudio comparativo de los sistemas DAVIH-HTLV-I y Vironostika HTLV-I/II se pueden observar en la tabla 3. Los mismos mostraron una concordancia de 96,55 %. Esto se debe a cuatro muestras positivas que fueron no reactivas por el sistema DAVIH HTLV-I.
Precisión
Los resultados de este estudio se resumen en las tablas 4 y 5. Para la repetibilidad, excepto en la muestra tres, cuyo CV fue de 12,98 %, no se apreciaron valores de CV superiores al 10 %. En el caso de la precisión intermedia los resultados mostraron CV que fueron inferiores al 20 % para las muestras 1 y 3, y la muestra 2 mostró un CV de 22,34 %.
Robustez
En la evaluación de la robustez, los CV para las 12 réplicas de cada una de las muestras reactivas y no reactivas, fueron inferiores al 20 % a las tres temperaturas estudiadas: 36, 37 y 38°C; no observamos contaminación cruzada entre las muestras reactivas y no reactivas durante los procesos de lavado.
DISCUSIÓN
Cuba no cuenta con un diagnosticador que permita el pesquisaje del HTLV I. Esto puede estar dado por las bajas tasas de seroprevalencia reportadas y por las consideraciones económicas sobre el alto costo de la incorporación de este ensayo a los sistemas de detección en la red nacional de laboratorios para la vigilancia epidemiológica y la certificación de la sangre. La evidencia de la propagación del HTLV-I por contacto sexual y a través de la sangre, hace que sea útil establecer una serovigilancia de las infecciones por retrovirus no VIH.11
La factibilidad de uso del DAVIH-HTLV-I, de producción nacional, en el pesquisaje de la infección por HTLV-I en suero o plasma humano, se demostró con los resultados del desempeño del sistema.
La especificidad diagnóstica mostró resultados que concuerdan con lo esperado para este tipo de ensayo.7,10 En el estudio de especificidad analítica se apreciaron reacciones inespecíficas en las muestras con anticuerpos antinucleares y con anticuerpos contra el VIH-1; lo cual se ha descrito que pueda ocurrir por la presencia de una enfermedad autoinmune12 y por la reactividad cruzada que puede existir entre dos retrovirus13 respectivamente.
Aunque los resultados de sensibilidad fueron inferiores a los valores esperados para un sistema de pesquisaje (99-100 %),7,10 debemos tener en cuenta que el 100 % de las muestras de pacientes seropositivos cubanos incluidas en el panel LISIDA fueron reactivas, lo cual demuestra la utilidad del sistema en nuestra población. Este porcentaje pudo verse afectado por el número pequeño de muestras empleados en el estudio debido a que el HTLV-I es menos transmisible y ha sido menos estudiado que el VIH.1,4
Otro de los factores que puede haber influido en los resultados de sensibilidad y especificidad es el hecho de que el antígeno empleado para recubrir la fase sólida es natural y se ha descrito que cuando se emplea este tipo de antígeno en ensayos inmunoenzimáticos, disminuye la posibilidad de unión de las secuencias inmunodominantes a la fase sólida y también existe la posibilidad de que los componentes celulares enmascaren los resultados por la respuesta cruzada de los anticuerpos inespecíficos.14
La concordancia con el sistema de referencia Vironostika HTLV I/II no difiere de otros estudios comparativos realizados entre diferentes técnicas para la detección de HTLV-I, donde se ha encontrado que la prueba de ELISA ha mostrado niveles de concordancia significativamente mayores que los observados en otras pruebas como el Western Blot o la PCR (80 %).15
Del estudio de precisión podemos decir que, excepto para la muestra 3 de la repetibilidad y 2 de la precisión intermedia, los CV obtenidos concuerdan con lo referido por Ochoa10 y por el CECMED,7 quienes plantean que en los inmunoensayos enzimáticos el coeficiente de variación no debe superar el 10 % en la prueba de precisión intraensayo y el 20 % en la interensayo; y se consideran óptimos los inferiores al 5 % y al 10 % respectivamente.
En el caso de la muestra 3 de la repetibilidad, se observó una mayor dispersión en los valores, lo cual se traduce en una disminución de la precisión; que puede explicarse debido a que los mismos se encuentran muy cercanos al valor de corte.16,17 Para la muestra 2 de la precisión intermedia, el CV obtenido puede deberse a la diferencia que existe entre los antígenos que recubren la fase sólida de ambos lotes.17
En el estudio de robustez, los resultados están acorde a lo descrito por Ochoa y el CECMED, para los ensayos inmunoenzimáticos.7,10 Se demostró la capacidad del método para brindar resultados consistentes a 36, 37 y 38 °C.
Los resultados obtenidos avalan a este ensayo como una herramienta importante en el diagnóstico de la infección por HTLV-I, por lo que se recomendó su registro ante el órgano regulatorio de la república de Cuba (CECMED).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 11 de
enero de 2015.
Aprobado 20 de febrero de 2015.
Lic. Kenia Romero Martínez. Laboratorio de Investigaciones del SIDA (LISIDA). Carretera de Tapaste y Autopista Nacional. La Habana, Cuba. Correo electrónico: calidad@dcn.co.cu; cicdc@infomed.sld.cu
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