Identificaci贸n de especies de Leishmania mediante PCR en tiempo real acoplada a curvas de fusi贸n de alta resoluci贸n

Introducci贸n: La leishmaniasis es una enfermedad causada por par谩sitos del g茅nero Leishmania. En Colombia se han informado 10 especies pat贸genas. El diagn贸stico parasitol贸gico tradicional basado en la observaci贸n de los par谩sitos no permite identificar la especie, por lo cual se deben emplear m茅todos moleculares, entre ellos la reacci贸n en cadena de la polimerasa o PCR convencional, pero esta presenta algunas limitaciones y requiere extensos periodos de tiempo para la obtenci贸n de resultados, que en ocasiones no son concluyentes.

Objetivo: Evaluar un m茅todo basado en PCR en tiempo real acoplado a curva de temperatura de desnaturalizaci贸n media de alta resoluci贸n (PCR-HRM) que permita el diagn贸stico y la identificaci贸n simult谩nea de par谩sitos del g茅nero Leishmania en muestras cl铆nicas de humanos y en cultivos in vitro de manera sensible y espec铆fica.

M茅todos: Se estandariz贸 una PCR-HRM, mediante la cual se evaluaron 237 muestras cl铆nicas, 98 clasificadas como positivas y 139 como negativas, parasitol贸gicamente por directo y/o cultivo. Las tipificaciones fueron comparadas con los resultados en paralelo obtenidos de una variante de la RCP, realizando cortes al amplicon que gener贸 un fragmento de restricci贸n de longitud polim贸rfica o PCR-RFLP que hab铆a sido previamente estandarizada.

Resultados: Se logr贸 implementar una PCR-HRM para el diagn贸stico e identificaci贸n de especies de Leishmania, logrando un 100 % de concordancia con las tipificaciones obtenidas por PCR-RFLP. Incluso, se logr贸 detectar e identificar el par谩sito en muestras diagnosticadas como negativas por los m茅todos convencionales. Se encontr贸 que con un porcentaje de confiabilidad superior al 95 %, se lograron tipificar 91 muestras de 98; de estas el 81,63 % de los casos fueron L. panamensis, el 11,22% L. braziliensis e indeterminadas el 7,14 % de los casos.

Conclusiones: La PCR-HRM es un buen m茅todo que permite la identificaci贸n de las especies m谩s prevalentes en Colombia, comparando temperaturas medias de desnaturalizaci贸n espec铆ficas seg煤n la especie de Leishmania involucrada.

Rafael Guillermo Villarreal Julio, Giovanny Herrera, Carlos Enrique Muskus L贸pez
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Normalizaci贸n de una nueva variante de reacci贸n en cadena de la polimerasa-hsp 20 (PCR-hsp20S) 煤til para la detecci贸n de Leishmania

Introducci贸n: La leishmaniasis es una parasitosis producida por m谩s de 20 especies de Leishmania. La enfermedad tiene una amplia distribuci贸n mundial en zonas tropicales y subtropicales y se presenta en tres formas cl铆nicas fundamentales: la leishmaniasis cut谩nea, mucocut谩nea y visceral. Existen varios procedimientos de laboratorio para realizar el diagn贸stico, pero contin煤a la investigaci贸n acerca de la detecci贸n molecular del par谩sito ante la falta de consenso sobre los protocolos en uso.
Objetivos: desarrollar y normalizar una nueva reacci贸n en cadena de la polimerasa (PCR), que amplifique un fragmento m谩s corto del gen hsp20.
M茅todos: Se utilizaron cepas de referencia del par谩sito para realizar la normalizaci贸n de un nuevo ensayo de PCR que amplifica un fragmento corto del gen que codifica para la peque帽a prote铆na de 20 Kda. Se evaluaron las cantidades y concentraciones 贸ptimas del ensayo, la sensibilidad anal铆tica para L. braziliensis, la especificidad anal铆tica as铆 como la repetibilidad, y se evalu贸 su desempe帽o con cepas de referencia.
Resultados: Se determinaron las condiciones 贸ptimas de amplificaci贸n de la nueva PCR-hsp20S, y se demostr贸 que amplifica las principales especies de importancia m茅dica. La sensibilidad anal铆tica result贸 en 100 fg para L. braziliensis.
Conclusiones: Las condiciones establecidas garantizan un buen desempe帽o de esta propuesta de PCR, y la sensibilidad anal铆tica y especificidad obtenidas permiten evaluar su desempe帽o para el diagn贸stico utilizando muestras cl铆nicas. Las condiciones de este protocolo, sensibilidad y especificdad y otros par谩metros establecidos permiten recomendar su evaluaci贸n para su posible uso diagn贸stico.

Ana Margarita Montalvo, Jorge Fraga, Lisandra 脕lvarez, Annia Alba, Cecia Torres
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Leishmania y leishmaniasis. Veinte a帽os de estudio en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kour铆": aportes y perspectivas

Introducci贸n: la leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por varias especies del g茅nero Leishmania, protozoo par谩sito que no circula en Cuba de forma aut贸ctona. Sin embargo, se presentan casos importados. Existen tres formas cl铆nicas principales y diversos m茅todos para realizar el diagn贸stico, que incluyen los parasitol贸gicos, serol贸gicos y m谩s recientemente, los moleculares. El tratamiento de elecci贸n son los antimoniales pentavalentes, los cuales presentan inconvenientes que han estimulado la b煤squeda de nuevas alternativas terap茅uticas.
Objetivos: resumir los resultados de trabajo obtenidos en el estudio de Leishmania durante 20 a帽os y explicar las razones que motivaron la capacitaci贸n, entrenamiento e investigaci贸n de esta entidad en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kour铆".
M茅todos: se realiz贸 un estudio bibliom茅trico y se analizaron todos los resultados de trabajo del grupo de Leishmania del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kour铆" durante 20 a帽os. Se consultaron todas las publicaciones realizadas en el grupo y se determinaron los resultados fundamentales en las principales l铆neas de investigaci贸n.
Resultados: se describen los aportes m谩s importantes en 谩reas de investigaci贸n como la inmunizaci贸n con ADN, el diagn贸stico molecular y la b煤squeda de nuevas alternativas terap茅uticas, y se remite al lector a consultar las publicaciones que contienen los detalles de cada estudio. Se mencionan las colaboraciones principales con centros nacionales y extranjeros. Se comentan las perspectivas futuras del trabajo del grupo de investigaci贸n.
Conclusiones: el grupo ha acometido l铆neas de investigaci贸n de inter茅s y es responsable del mayor aporte del pa铆s en el campo de investigaci贸n de este par谩sito, en correspondencia con su misi贸n. La continuidad de la investigaci贸n, contribuir a la soluci贸n de algunos de los problemas a煤n no resueltos de esta parasitosis y la aplicaci贸n de los resultados obtenidos, ser谩 un reto para los pr贸ximos a帽os.

Ana Margarita Montalvo 脕lvarez, Lianet Monzote Fidalgo
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驴Leishmaniasis o psoriasis? Diagn贸stico diferencial

Introducci贸n: la leishmaniasis es una enfermedad parasitaria causada por varias especies del g茅nero Leishmania, que se presenta en formas cl铆nicas muy diversas. Entre las formas cut谩neas, se ha notificado ocasionalmente la leishmaniasis psoriasiforme. Es imprescindible tener la certeza diagn贸stica de leishmaniasis dada la toxicidad y los efectos colaterales que tienen las drogas de primera l铆nea para tratarla. Se emplean varios m茅todos para llegar al diagn贸stico, como son desde la identificaci贸n del par谩sito en el tejido hasta la detecci贸n de su ADN.
M茅todos
: se realiz贸 la recopilaci贸n y an谩lisis de la informaci贸n de un caso cl铆nico con supuesta leishmaniasis, y se aplicaron distintos m茅todos de laboratorio para definir el diagn贸stico, tales como examen parasitol贸gico directo, examen histopatol贸gico, cultivo y reacci贸n en cadena de la polimerasa (PCR-18S y PCR-hsp70).
Resultados y discusi贸n: los ex谩menes realizados para confirmar el diagn贸stico de leishmaniasis fueron negativos. Al estudio histol贸gico, la lesi贸n dermatol贸gica se concluye como psoriasis.
Conclusiones: aunque la literatura cient铆fica notifica casos de leishmaniasis de tipo psoriasiforme estos son escasos. El estudio integral del caso por diferentes m茅todos descart贸 la supuesta leishmaniasis en este paciente, lo cual permiti贸 la aplicaci贸n del tratamiento adecuado y evit贸 el uso indebido de antimoniales para su tratamiento.

Ana Margarita Montalvo Alvarez, Orestes Blanco Gonz谩lez, Virginia Cap贸 de Paz, Jorge Fraga Nodarse, Lianet Monzote Fidalgo
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