Cryptosporidium spp. en muestras de lavado broncoalveolar de pacientes VIH/sida en un hospital de Guayaquil, Ecuador

Introducci贸n: Cryptosporidium spp. son par谩sitos que causan infecciones respiratorias principalmente en pacientes inmunocomprometidos.

Objetivo: Detectar Cryptosporidium spp. en el lavado broncoalveolar (BAL) de pacientes VIH positivos y con s铆ndrome respiratorio.

M茅todos: Se seleccionaron 60 muestras de BAL y se analizaron mediante microscop铆a 贸ptica con tinci贸n de Ziehl-Neelsen y PCR de punto final; esta 煤ltima es una t茅cnica eficiente para el diagn贸stico de pat贸genos oportunistas. Se recolectaron datos cl铆nicos y epidemiol贸gicos de cada paciente.

Resultados: La prevalencia hallada en este estudio mediante PCR de punto final fue del 5 %. Los signos y s铆ntomas que se presentaron con mayor frecuencia, sobre todo en el grupo etario de 31 a 40 a帽os, fueron fiebre, tos y disnea; sin embargo, no se obtuvieron asociaciones estad铆sticamente significativas a ninguna de las variables y no se pudo visualizar par谩sitos mediante la tinci贸n de Ziehl-Neelsen.

Conclusi贸n: Cryptosporidium spp. puede causar infecciones pulmonares de dif铆cil reconocimiento cl铆nico, pues se confunde con otras infecciones oportunistas. En el presente estudio no puede establecerse si la detecci贸n del ADN parasitario correspondi贸 a una verdadera infecci贸n o solamente a colonizaci贸n, lo que es importante para implementar t茅cnicas con mayor sensibilidad para el diagn贸stico. Se debe considerar relevante la prevalencia encontrada en Ecuador, al ser inusualmente alta en comparaci贸n con pa铆ses cercanos como Brasil.

Sunny S谩nchez Giler, Luis Fernando Solorzano Alava, Francisco Ivan S谩nchez Amador, Dolores Zambrano, Karen Cevallos
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Diagn贸stico micol贸gico por t茅cnicas no convencionales en el siglo XXI

Introducci贸n: En la actualidad las infecciones f煤ngicas representan un problema para la salud humana. Las infecciones causadas por especies pat贸genas de hongos registran un incremento constante y se ubican entre el cuarto y d茅cimo lugar como causa de muerte, particularmente en las unidades de cuidado intensivo. Un diagn贸stico adecuado y precoz impacta directamente en la morbilidad y mortalidad asociadas a estas.

Objetivo: Describir las principales t茅cnicas de diagn贸stico no convencional de las enfermedades f煤ngicas m谩s frecuentes, en especial las relacionadas con el diagn贸stico serol贸gico y molecular. Mtodos: Se realiz贸 una revisi贸n de la literatura cient铆fica sobre el tema, publicada entre 2000 y 2019. Se revisaron un total de 63 trabajos. Como motores de b煤squeda se emplearon Google y Google Scholar. Se revisaron las bases de datos Medline, PubMed, Science Direct, BUCea y SciELO.

An谩lisis y s铆ntesis de la informaci贸n: Las t茅cnicas serol贸gicas se emplean en el diagn贸stico de las micosis invasivas o sist茅micas por ser f谩ciles, r谩pidas y confiables. La detecci贸n de anticuerpos tiene utilidad limitada en el diagn贸stico de las micosis invasivas debido a que la respuesta puede estar retrasada, reducida o no existir en pacientes inmunocomprometidos. La detecci贸n de componentes no antig茅nicos liberados por los hongos durante la infecci贸n y la secuenciaci贸n de 谩cidos nucleicos f煤ngicos son otras opciones para el diagn贸stico de las micosis.

Conclusiones: El desarrollo biotecnol贸gico aporta nuevas herramientas que incrementan las oportunidades de identificaci贸n de las micosis. En la actualidad se disponen de m茅todos basados tanto en la detecci贸n de marcadores inmunol贸gicos como de elementos moleculares espec铆ficos. La eficacia de las herramientas no convencionales para el diagn贸stico depende de la correcta combinaci贸n de estas.

Elizabeth Fuentes Feria, Mar铆a Teresa Illnait.Zaragoz铆
 
Identificaci贸n de especies de Leishmania mediante PCR en tiempo real acoplada a curvas de fusi贸n de alta resoluci贸n

Introducci贸n: La leishmaniasis es una enfermedad causada por par谩sitos del g茅nero Leishmania. En Colombia se han informado 10 especies pat贸genas. El diagn贸stico parasitol贸gico tradicional basado en la observaci贸n de los par谩sitos no permite identificar la especie, por lo cual se deben emplear m茅todos moleculares, entre ellos la reacci贸n en cadena de la polimerasa o PCR convencional, pero esta presenta algunas limitaciones y requiere extensos periodos de tiempo para la obtenci贸n de resultados, que en ocasiones no son concluyentes.

Objetivo: Evaluar un m茅todo basado en PCR en tiempo real acoplado a curva de temperatura de desnaturalizaci贸n media de alta resoluci贸n (PCR-HRM) que permita el diagn贸stico y la identificaci贸n simult谩nea de par谩sitos del g茅nero Leishmania en muestras cl铆nicas de humanos y en cultivos in vitro de manera sensible y espec铆fica.

M茅todos: Se estandariz贸 una PCR-HRM, mediante la cual se evaluaron 237 muestras cl铆nicas, 98 clasificadas como positivas y 139 como negativas, parasitol贸gicamente por directo y/o cultivo. Las tipificaciones fueron comparadas con los resultados en paralelo obtenidos de una variante de la RCP, realizando cortes al amplicon que gener贸 un fragmento de restricci贸n de longitud polim贸rfica o PCR-RFLP que hab铆a sido previamente estandarizada.

Resultados: Se logr贸 implementar una PCR-HRM para el diagn贸stico e identificaci贸n de especies de Leishmania, logrando un 100 % de concordancia con las tipificaciones obtenidas por PCR-RFLP. Incluso, se logr贸 detectar e identificar el par谩sito en muestras diagnosticadas como negativas por los m茅todos convencionales. Se encontr贸 que con un porcentaje de confiabilidad superior al 95 %, se lograron tipificar 91 muestras de 98; de estas el 81,63 % de los casos fueron L. panamensis, el 11,22% L. braziliensis e indeterminadas el 7,14 % de los casos.

Conclusiones: La PCR-HRM es un buen m茅todo que permite la identificaci贸n de las especies m谩s prevalentes en Colombia, comparando temperaturas medias de desnaturalizaci贸n espec铆ficas seg煤n la especie de Leishmania involucrada.

Rafael Guillermo Villarreal Julio, Giovanny Herrera, Carlos Enrique Muskus L贸pez
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Liena de Regla Ponce Rey, Maday Alonso del Rivero Antigua, Sonia Resik Aguirre
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Evaluaci贸n de estuches de PCR-tiempo real para detecci贸n de virus del papiloma humano de alto riesgo

Introducci贸n: El empleo de t茅cnicas moleculares para el diagn贸stico de virus del papiloma humano de alto riesgo oncog茅nico (VPH-AR) es crucial para la detecci贸n precoz del c谩ncer cervicouterino.

Objetivo: Evaluar el desempe帽o anal铆tico de dos estuches de PCR-tiempo real, comercializados por el Centro de Inmunoensayo de Cuba, para detectar VPH-AR.

M茅todos: Se utilizaron dos paneles de ADN de muestras cervicouterinas: uno con 150 muestras, para validar el estuche SUMASIGNAL HPV 16/18, el proceso de extracci贸n de ADN y su utilidad como prueba cuantitativa, y otro con 163 muestras para evaluar el estuche HPV 13+2. Se determin贸 la utilidad cl铆nica del estuche HPV 13+2 en 55 muestras cervicovaginales autocolectadas. Se calcularon los indicadores de desempe帽o anal铆tico de ambos estuches con respecto a pruebas de referencia.

Resultados: Los indicadores de desempe帽o para SUMASIGNAL HPV 16/18 fueron excelentes (> 95 %), concordancia 96 %, 铆ndice kappa=0,93 [0,85-1,01]. La extracci贸n de ADN mostr贸 100 % de especificidad cl铆nica y anal铆tica y 95 % de sensibilidad anal铆tica. Se obtuvo buena correlaci贸n con la prueba de referencia cuantitativa (r = + 0,688). El estuche HPV 13+2 tuvo especificidad y sensibilidad cl铆nicas del 100 %, la especificidad anal铆tica fue del 84 % debido a reactividad cruzada con otros VPH-AR. Su aplicaci贸n cl铆nica revel贸 alta frecuencia de infecci贸n (41,8 %): 23,6 % con VPH-AR, particularmente en mujeres j贸venes (50 %). La muestra autocolectada result贸 煤til (100 %).

Conclusi贸n: Los ensayos evaluados mostraron altos est谩ndares de calidad, lo que permitir铆a su uso con una cobertura nacional en una plataforma tecnol贸gica disponible para todo el pa铆s.

Yudira Soto Brito, Yailen S谩nchez Dom铆nguez, Darien Ortega Le贸n, Vivian Kouri Cardell谩, Ariel Palenzuela D铆az, Licel de los 脕ngeles Rodr铆guez Lay, Yaim茅 Josefina Gonz谩lez Gonz谩lez, Celeste Ram铆rez Cardentey, Yoanna Ba帽os Morales
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Rafael Guillermo Villarreal Julio, Enderson Murillo Ramos, Rene Ram铆rez Garc铆a, Ronald Guillermo Pel谩ez S谩nchez, Freddy Ruiz L贸pez, Luz Adriana Agudelo, Iv谩n Dar铆o V茅lez Bernal, Carlos Enrique Muskus L贸pez, Juan 脕lvaro L贸pez Quintero, Piedad Matilde Agudelo Fl贸rez
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Normalizaci贸n de una nueva variante de reacci贸n en cadena de la polimerasa-hsp 20 (PCR-hsp20S) 煤til para la detecci贸n de Leishmania

Introducci贸n: La leishmaniasis es una parasitosis producida por m谩s de 20 especies de Leishmania. La enfermedad tiene una amplia distribuci贸n mundial en zonas tropicales y subtropicales y se presenta en tres formas cl铆nicas fundamentales: la leishmaniasis cut谩nea, mucocut谩nea y visceral. Existen varios procedimientos de laboratorio para realizar el diagn贸stico, pero contin煤a la investigaci贸n acerca de la detecci贸n molecular del par谩sito ante la falta de consenso sobre los protocolos en uso.
Objetivos: desarrollar y normalizar una nueva reacci贸n en cadena de la polimerasa (PCR), que amplifique un fragmento m谩s corto del gen hsp20.
M茅todos: Se utilizaron cepas de referencia del par谩sito para realizar la normalizaci贸n de un nuevo ensayo de PCR que amplifica un fragmento corto del gen que codifica para la peque帽a prote铆na de 20 Kda. Se evaluaron las cantidades y concentraciones 贸ptimas del ensayo, la sensibilidad anal铆tica para L. braziliensis, la especificidad anal铆tica as铆 como la repetibilidad, y se evalu贸 su desempe帽o con cepas de referencia.
Resultados: Se determinaron las condiciones 贸ptimas de amplificaci贸n de la nueva PCR-hsp20S, y se demostr贸 que amplifica las principales especies de importancia m茅dica. La sensibilidad anal铆tica result贸 en 100 fg para L. braziliensis.
Conclusiones: Las condiciones establecidas garantizan un buen desempe帽o de esta propuesta de PCR, y la sensibilidad anal铆tica y especificidad obtenidas permiten evaluar su desempe帽o para el diagn贸stico utilizando muestras cl铆nicas. Las condiciones de este protocolo, sensibilidad y especificdad y otros par谩metros establecidos permiten recomendar su evaluaci贸n para su posible uso diagn贸stico.

Ana Margarita Montalvo, Jorge Fraga, Lisandra 脕lvarez, Annia Alba, Cecia Torres
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Infecciones m煤ltiples por Alphapapillomavirus, especie 9, en mujeres ecuatorianas con lesiones intraepiteliales y c谩ncer cervicouterino

Introducci贸n: El significado biol贸gico de las infecciones m煤ltiples con virus del papiloma humano de alto riesgo oncog茅nico (VPH-AR), pertenecientes a la familia Alphapapillomavirus, en la carcinog茅nesis cervical a煤n es controversial.

Objetivo: Proporcionar informaci贸n sobre la circulaci贸n del VPH-AR del g茅nero Alphapapillomavirus-especie 9, e infecciones m煤ltiples en mujeres ecuatorianas con lesiones intraepiteliales y c谩ncer cervicouterino (CaCU).

M茅todos: Se estudiaron 300 mujeres, residentes en la regi贸n Litoral del Ecuador. Se detect贸 la infecci贸n viral en muestras cervicales, mediante PCR anidada con cebadores gen茅ricos MY09/11 y GP5/GP6. Los genotipos virales fueron identificados con el sistema comercial ANYPLEX II VPH28. La raz贸n de prevalencia (RP) fue utilizada como medida de asociaci贸n entre las lesiones citol贸gicas y las infecciones simples, m煤ltiples o combinaciones de genotipos.

Resultados: Se detect贸 VPH en el 92,00 % (276/300) de las mujeres, con frecuencias altas de infecci贸n por genotipos individuales, principalmente de alto riesgo oncog茅nico. Los VPH-AR m谩s frecuentes fueron VPH58 (18,17 %), 70 (8,64 %), 53 (8,34 %), 35 (7,45 %), 16聽(7,37聽%), 33 (6,55 %), 31 (5,58 %) y 18聽(4,24聽%). En el 91,66 % (253/276) de las muestras se detectaron infecciones m煤ltiples, hasta con 13聽tipos en una misma paciente, incluyendo varias especies del g茅nero Alphapapillomavirus. La combinaci贸n VPH16/VPH58 fue la m谩s frecuente en lesiones de alto grado (RP = 2,9; p = 0,000), y la coinfecci贸n triple VPH16/VPH58/VPH70 predomin贸 en las mujeres con CaCU (RP = 3,5; p = 0,007).

Conclusi贸n: Los resultados demuestran que la combinaci贸n VPH16/VPH58 del g茅nero Alphapapillomavirus, especie 9, podr铆a ser un factor clave en la aparici贸n de lesiones premalignas y su progresi贸n hacia el CaCU.

C茅sar Humberto Bedoya Pilozo, Yudira Soto Brito, Maylen Espinosa Garc铆a, Peter Chedraui 脕lvarez, Gustavo Sa煤l Escobar Valdiviezo, Rita Loja Chango, Sunny S谩nchez Giler, Vivian Kouri Cardell谩
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Escherichia coli diarrog茅nicos, identificaci贸n de patotipos y fenotipos de resistencia antimicrobiana en aislados cubanos

Introducci贸n: En los pa铆ses en v铆as de desarrollo las enfermedades diarreicas agudas son causa frecuente de morbilidad y mortalidad. Entre las primeras causas se encuentra Escherichia coli diarrog茅nicos, que afecta a pacientes en edades extremas de la vida y con inmunodeficiencias.

Objetivo: Identificar los patotipos de Escherichia coli diarrog茅nicos que m谩s inciden y los fenotipos de resistencia antimicrobiana expresados por el patotipo predominante. M茅todos: Se estudiaron 184 aislamientos procedentes de 15 centros provinciales de Higiene, Epidemiolog铆a y Microbiolog铆a de Cuba e Isla de la Juventud. La investigaci贸n se realiz贸 desde julio de 2012 hasta febrero de 2014. La identificaci贸n de g茅nero, especie y patotipos fue realizada por m茅todos de diagn贸stico convencional y molecular. La determinaci贸n de la susceptibilidad antimicrobiana se realiz贸 por el m茅todo de Bauer y Kirby, y las normas del Clinical and Laboratory Institute Standards de 2013.聽

Resultados: Se identificaron 108 (58 %) Escherichia coli diarrog茅nicos. Los patotipos confirmados fueron: en la PCR m煤ltiple 1, 5 (6 %) de Escherichia coli enteropatog茅nico, 4 (4 %) de enterotoxig茅nico y 0 (0 %) de enterohemorr谩gico. La PCR m煤ltiple 2 revel贸 72 (82 %) Escherichia coli enteroagregativo, que result贸 el predominante en el estudio. La PCR 3 (simple) detect贸 7 (8 %) de enteroinvasivo. El 100 % del patotipo predominante mostr贸 resistencia, al menos a un antimicrobiano de los probados, un solo patron de resistencia a dos antimicrobianos, y nueve patrones de multirresistencia.

Conclusiones: El estudio demuestra la importancia del uso de pruebas moleculares r谩pidas para la confirmaci贸n de los patotipos de E. coli diarrog茅nicos, los que provocan deshidrataci贸n ligera, complicaciones graves y la muerte. Se logra identificar los cuatro patotipos m谩s frecuentes y E. coli enteroagregativo, el de mayor incidencia en la poblaci贸n estudiada. El patotipo predominante mostr贸 altos porcentaje de resistencia antimicrobiana a betalact谩micos y buena sensibilidad antimicrobiana a los aminogluc贸sidos y cefalosporinas de tercera generaci贸n. La investigaci贸n aporta conocimientos, no revelados en estudios anteriores con aislados cubanos, lo que es considerado de alto valor para los cl铆nicos, pediatras y epidemi贸logos del pa铆s.

Adalberto Aguila S谩nchez, Ariadna Rodriguez P茅rez, Sussel Abreu Blanco, Anabel Fernandez Abreu, Yanaika Cruz Infantes, Laura Bravo Fari帽a, Jenny L谩zara Hernandez Martinez, Diana Bebelagua Cruz
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M茅todo de reacci贸n en cadena de la polimerasa para determinar la replicaci贸n del virus de la hepatitis B

Objetivo: evaluar el desempe帽o cl铆nico de un m茅todo de reacci贸n en cadena de la polimerasa con modificaciones para la detecci贸n de la replicaci贸n del virus de la hepatitis B en pacientes infectados.
M茅todos: se estudiaron 266 muestras de suero de pacientes provenientes de los servicios de Gastroenterolog铆a, Trasplante, Hemodi谩lisis y Hematolog铆a del Hospital Cl铆nicoquir煤rgico "Hermanos Ameijeiras", con el ant铆geno de superficie (HBsAg) positivo y altos valores de enzimas hep谩ticas (aspartatoaminotransferasa, aspartatoaminotransglutaminasa y ganmaglutamiltrasferasa), as铆 como 5 muestras de individuos cl铆nicamente sanos. El ADN se extrajo mediante el m茅todo del fenol-cloroformo. Se amplific贸 un fragmento de la regi贸n Pre S del virus de la hepatitis B y un fragmento del gen de la 脽-globina como control interno de la reacci贸n.
Resultados: El fragmento del gen de la 脽-globina se verific贸 en las 266 muestras estudiadas. La regi贸n Pre S del virus de la hepatitis B en cambio, fue detectada en 103 de ellas, siendo informadas como positivas para la replicaci贸n viral. En la muestra se obtuvo una prevalencia 98,15 % para la replicaci贸n del virus de la hepatitis B. La especificidad cl铆nica del ensayo fue del 100 %, la sensibilidad cl铆nica del 38 %, el valor predictivo positivo del 100 % y el valor predictivo negativo del 64 %. El an谩lisis de concordancia no mostr贸 acuerdo (魏= 0,022 para una p= 0,07) entre las enzimas hep谩ticas y la reacci贸n en cadena de la polimerasa. Los ensayos de repetitividad y de reproducibilidad mostraron que los resultados son reproducibles. El mayor porcentaje de positividad se encontr贸 en los pacientes remitidos por el Servicio de Hematolog铆a (66,7 %).
Conclusiones: el m茅todo de reacci贸n en cadena de la polimerasa evaluado constituye una herramienta certera para el monitoreo de la replicaci贸n del virus de la hepatitis B. Contar con su implementaci贸n y aplicaci贸n en la instituci贸n que se efetu贸 el estudio reviste gran importancia para el sistema de salud del pa铆s.

Maria Teresa Mart铆nez Echevarr铆a, Suchiquil Rangel Velazquez, Gissel Garc铆a Men茅ndez, Amarylis Mart铆nez Piedra, Pedro E. Velbes Marquetti, Ra煤l Pablo Ferreira Capote
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Maria Teresa Mart铆nez Echevarr铆a, Ra煤l Pablo Ferreira Capote, Isis Amores S谩nchez, Amarylis Mart铆nez Piedra, Rita Rosa Santana Hern谩ndez, 脕ngela Rosa Guti茅rrez Rojas, Gissel Garc铆a Men茅ndez
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Prevalencia genot铆pica de cagA y vacA en aislamientos de Helicobacter pylori de pacientes colombianos

Introducci贸n: El gen de la toxina vacuolizante (vacA) y el gen asociado a citotoxina (cagA) son considerados los principales factores de virulencia de Helicobacter pylori, los cuales generan mayor prevalencia e incidencia de patogenicidad.
Objetivo: Determinar la prevalencia del gen cagA y las variantes al茅licas del gen vacA en cepas de H. pylori aisladas de pacientes colombianos.
M茅todos: Se incluyeron 72 pacientes que fueron remitidos a endoscopia a la Cl铆nica San Marcel de la ciudad de Manizales, Colombia, durante el segundo semestre del a帽o 2015, a quienes se les tom贸 una biopsia de antro y una de cuerpo g谩strico para cultivo microbiol贸gico y posterior estudio molecular. La extracci贸n de ADN bacteriano se realiz贸 por el m茅todo descrito por Valentine. La identificaci贸n de los factores de virulencia cagA y vacA se efectu贸 por reacci贸n en cadena de la polimerasa convencional, empleando iniciadores espec铆ficos para cada uno de ellos.
Resultados: Se obtuvieron aislamientos de Helicobacter pylori de 16 pacientes, de los cuales se identificaron cepas cagA positivas y las variantes al茅licas s1 y s2 asociadas al gen vacA. No se encontr贸 asociaci贸n estad铆sticamente significativa entre el diagn贸stico endosc贸pico y los factores de virulencia de los genes cagA y vacA.
Conclusiones: Hubo una prevalencia del 50 % de cagA+ y una frecuencia 68,8 % para las variantes al茅licas VacAs1m1 en los aislamientos de H. pylori obtenidos de las biopsias g谩stricas, lo que denota que factores diferentes y que complementan la virulencia bacteriana se asocian a la presentaci贸n de condiciones gastrointestinales, con implicaciones diagn贸sticas, pron贸sticas y terap茅uticas.

Paula Tatiana Uribe Echeverry, Maria Alejandra Acosta Cerquera, Brenda Lucia Arturo Arias, Maria del Socorro Jaramillo Arredondo, Jhon Fredy Betancur P茅rez, Juan Manuel P茅rez Agudelo
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Evaluaci贸n de una PCR para la confirmaci贸n molecular de leptospirosis en fallecidos a partir de tejidos frescos

Introducci贸n: la leptospirosis humana es una enfermedad infecciosa aguda que sin diagn贸stico y tratamiento temprano puede conllevar a la muerte del paciente. En Cuba son escasos los estudios relacionados con la detecci贸n molecular de Leptospira en muestras de fallecidos.
Objetivo: evaluar una metodolog铆a de Reacci贸n en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detecci贸n de ADN de leptospiras pat贸genas en muestras frescas de tejidos de fallecidos con sospecha de leptospirosis.
M茅todos: se evalu贸 y aplic贸 una PCR para la detecci贸n de ADN de Leptospira spp. pat贸genas en el per铆odo 2012-2013. Esta PCR se estim贸 utilizando cultivos de leptospiras y en tejidos humanos infectados artificialmente con leptospiras pat贸genas. Adem谩s la PCR se aplic贸 a muestras de 贸rganos frescos de fallecidos con sospecha de leptospirosis, comparando los resultados con otra PCR reportada y usada para muestras frescas post-mortem.
Resultados: la PCR evaluada result贸 m谩s sensible que la PCR empleada como referencia, y permiti贸 confirmar la infecci贸n por leptospiras pat贸genas en el 34,2 % (42/123) de las muestras cl铆nicas de 贸rganos frescos, mientras la de referencia en el 17,9 % (22/123), lo que demuestra la utilidad de esta nueva herramienta.
Conclusi贸n: la PCR evaluada constituye una herramienta sensible y 煤til para la confirmaci贸n de leptospirosis en fallecidos.

Angel Alberto Noda Ramos, Islay Rodr铆guez Gonz谩lez, Yaindrys Rodr铆guez Olivera, Anamays Gov铆n Ch谩vez, Ana Margarita Obreg贸n Fuentes
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